Рассмотрим ситуацию, когда одиночная бактериальная клетка помещена в питательную среду и находится в условиях, оптимальных для роста. Перепишите таблицу и заполните ее, исходя из предположения, что эта клетка и все ее потомки делятся каждые 20 мин.

На основе данных заполненной вами таблицы постройте графики. По вертикальной оси отложите число бактерий (кривая А) и десятичный логарифм этого числа (кривая Б), а по горизонтальной оси - время. Что можно сказать о форме этих кривых?

Когда число клеток увеличивается , как видно из заполненной вами таблице, говорят о логарифмическом, экспоненциальном или геометрическом росте . В этом случае мы получим экспоненциальный ряд чисел. Это гораздо легче понять, если посмотреть на строку В в таблице, где число бактерий выражено в виде числа 2, возведенного в соответствующую степень. Показатель степени можно назвать логарифмом или экспонентной числа 2. Логарифмы, или экспоненты, образуют линейный ряд 0, 1, 2, 3 и т. д., соответствующий числу генераций.

Вернемся к таблице; вместо чисел, расположенных в строке А, можно записать их логарифмы по основанию 2 следующим образом:

Сравните строки В и Г. Однако обычно пользуются десятичными логарифмами (см. строку Б). В этом случае 1 = 10°, 2 = 10 0,3 , 4 = 10 0,6 и т. д.

Кривая, полученная на основе данных строки А, называется логарифмической или экспоненциальной кривой. Такую кривую можно преобразовать в прямую, построив график изменения числа клеток во времени. Тогда в идеальных условиях рост бактерий теоретически должен быть экспоненциальным. Сравним эту математическую модель с кривой роста реальной популяции бактерий, изображенной на рисунке. Отчетливо видны четыре фазы роста.

1. Во время лаг-фазы бактерии адаптируются к новой среде обитания, и поэтому рост пока еще не достигает максимальной скорости. В этот период у бактерий могут, например, синтезироваться новые ферменты, необходимые для усвоения тех питательных веществ, которые содержатся в новой среде.

2. Логарифмическая фаза - это фаза, когда бактерии растут с максимальной , число клеток увеличивается почти экспоненциально, а кривая роста представляет собой практически прямую.

3. В конце концов рост колонии начинает замедляться, и культура входит в стационарную фазу , когда скорость роста равна нулю и когда резко возрастает конкуренция за пищевые ресурсы. Образование новых клеток замедляется, а затем совсем прекращается. Увеличение числа клеток компенсируется одновременной гибелью других клеток, поэтому число жизнеспособных клеток остается постоянным.
Переход к этой фазе обусловлен действием нескольких факторов: снижением концентрации питательных веществ в среде, накоплением токсичных продуктов метаболизма, а в случае аэробных бактерий и уменьшением содержания кислорода в среде.

4. Во время последней фазы - фазы замедления роста - ускоряется гибель клеток и прекращается их размножение.

При выращивании бактерий в жидкой питательной среде наблюдается несколько фаз роста культур:

1. Фаза исходная (латентная) -- микробы адаптируются к питательной среде, увеличивается размер клеток. К концу этой фазы начинается размножение бактерий.

2. Фаза логарифмического инкубационного роста -- идет интенсивное деление клеток. Длится эта фаза около 5 часов. При оптимальных условиях бактериальная клетка может делиться каждые 15--30 мин.

3. Стационарная фаза -- число вновь появившихся бактерий равно числу отмерших. Продолжительность этой фазы выражается в часах и колеблется в зависимости от вида микроорганизмов.

4. Фаза отмирания -- характеризуется гибелью клеток в условиях истощения питательной среды и накопления в ней продуктов метаболизма микроорганизмов.

Посевной материал, попав в свежую полноценную среду, сразу не начинает размножения. Этот период называют лаг-фазой I. Только после определенного времени, иногда через несколько часов, клетки приспосабливаются к среде и окружающим условиям. В этот период активируются ферменты, а также, если это необходимо, синтезируются новые ферментные системы. В период лаг-фазы стремительно возрастает количество нуклеиновых кислот, особенно РНК, что необходимо для биосинтеза белков.

Рис. 1. Фазы роста культуры микроорганизмов: I -- лаг-фаза, II -- логарифмическая фаза, III -- фаза замедленного роста, IV -- стационарная фаза, V --фаза отмирания, N -- число клеток (млн/мл)

После лаг-фазы следует логарифмическая, или экспоненциальная, фаза II, в которой клетки размножаются с максимальной для данной культуры скоростью. Вследствие этого запас необходимых питательных веществ в среде уменьшается, кроме того, происходит накопление различных продуктов обмена веществ, которые в определенной концентрации могут мешать нормальному протеканию биохимических процессов обмена веществ. Иногда в питательной среде накапливается так много клеток, что не хватает пространства, а конкретнее, поверхности для новых поколений клеток. Именно через поверхность происходят процессы обмена -- попадание питательных веществ в клетку и выведение метаболитов. Если клетка находится в тесном окружении других клеток, то площадь поверхности уменьшается и вместе с тем снижается интенсивность процессов обмена. Скорость роста культуры также уменьшается, если сокращается поверхность клеток на единицу объема. Это происходит при увеличении размеров клеток и, таким образом, особенно для клеток сферической формы, значительно ухудшаются условия питания.

Как известно, поверхность сферических тел изменяется пропорционально квадрату их радиуса, а объем -- пропорционально кубу радиуса. Лимитирующие поверхности находятся, очевидно, и внутри клеток. В молекулярной биологии накапливается все больше фактов, которые указывают на то, что функционирование жизненных процессов необходимо связывать с биополимерами, мембранными структурами и их поверхностью.

В ходе интенсивного роста и размножения внутри закрытой системы негативное влияние лимитирующих факторов увеличивается и в результате скорость роста уменьшается, наступает фаза замедленного роста III. Через определенное время в стационарной фазе IV масса клеток в питательной среде достигает максимального уровня. Затем наступает период, когда число отмерших и автолизированных клеток превышает прирост. В результате количество биомассы уменьшается -- наступает фаза отмирания V.

Термин «рост» означает увеличение цитоплазматической массы отдельной клетки или группы бактерий в результате синтеза клеточного материала. Достигнув определенных размеров, клетка прекращает рост и начинает размножаться. Под размножением понимают способность микроорганизмов к самовоспроизведению, т.е. увеличению числа особей на единицу объема. Таким образом, размножение – это увеличение числа особей микробной популяции.

Бактерии размножаются преимущественно простым поперечным делением (вегетативное размножение) в различных плоскостях. Процесс деления начинается с формирования поперечной перегородки, которая делит цитоплазму материнской клетки на две дочерние. В процессе деления происходит репликация ДНК, таким образом, каждая дочерняя клетка получает свою наследственную информацию от материнской клетки.

У грибов различают три типа размножения: вегетативное, бесполое и половое.

При вегетативном размножении происходит отделение от мицелия его частей, которые, развиваясь, образуют новую грибницу.

Бесполое размножение осуществляется при помощи спор, которые созревают в специальных органах спороношения. Созревшие споры выходят в окружающую среду и, при наличии благоприятных условий, прорастают, давая начало новым гифам. Разновидностью бесполого размножения является почкование. Такой процесс характерен для дрожжевых грибов.

При половом размножении спорообразованию предшествует слияние гаплоидных мужских и женских гамет. В результате возникает зигота и наступает диплоидная фаза и парным набором хромосом. Половой процесс у разных видов грибов протекает различно и имеет свои особенности.

Репликация ДНК и деление клеток происходит определенной скоростью, которая зависит от вида микроорганизма, возраста культуры, состава питательной среды, температуры, наличия или отсутствия кислороды и некоторых других факторов. Так, у кишечной палочки новое поколение образуется через 15…30 минут, у нитрифицирующих бактерий – через 5…10 часов, а у микобактерий туберкулеза – через 18…24 ч. Чем оптимальнее условия, тем быстрее происходит деление микробной клетки. У той же кишечной палочки при культивировании на пептонной воде деление происходит через 33 мин, а при культивировании на мясопептонном бульоне – через 23 мин. На скорость деления большое влияние оказывает и температура окружающей среды. Так у патогенных микроорганизмов, адаптированных к температуре тела животных и человека, размножение при температуре 37…39 0 С происходит в несколько раз быстрее, чем при температуре 18…20 0 С.

Размножение микроорганизмов происходит хотя и быстро, но не безгранично. В естественных условиях имеется много факторов, которые лимитируют рост микробной популяции. К ним относятся: истощение питательной среды, неблагоприятная температура, свет, продукты жизнедеятельности самих микроорганизмов, накапливающиеся в питательной среде. Процесс развития бактериальной популяции на несменяемой среде протекает неравномерно, но имеет свои закономерности и определенную последовательность. В этом процессе принято различать несколько фаз. Фазы развития бактериальной популяции различаются по времени и численности живых и погибающих микроорганизмов. История развития каждой отдельной популяции будет существенно различаться, неизменной остается последовательность, с которой одна фаза сменяет другую.

I. Исходная фаза (стационарная, латентная, фаза покоя). Представляет собой период от момента посева бактерий на питательную среду до начала их роста. В этой фазе число бактерий не увеличивается, а может даже уменьшиться.

II. Фаза задержки размножения. В этот период бактериальные клетки интенсивно растут, но слабо размножаются. Продолжительность около двух часов и зависит от ряда условий: возраста культуры, биологических особенностей микроорганизмов, полноценности питательной среды, температуры и др.

III. Логарифмическая фаза. В этот период скорость размножения клеток и увеличение численности популяции максимальны.

IV. Фаза отрицательного ускорения. Наступает по причине истощения питательной среды, т.е. заканчиваются специфические питательные вещества, необходимые для жизнеспособности данного вида. Скорость размножения бактерий снижается, число делящихся особей снижается, а число погибших увеличивается.

V. Стационарная фаза максимума. Число новых бактерий почти равно числу отмерших, т.е. наступает равновесие между погибающими клетками и вновь образующимися.

VI. Фаза ускорения гибели. Прогрессирует превосходство числа погибших клеток над вновь образующимися.

VII. Фаза логарифмической гибели. Отмирание клеток происходит с постоянной скоростью.

Интенсивно протекающие в клетке процессы анаболизма и катаболизма приводят к быстрому росту клетки.

Рост бактерий - это упорядоченное увеличение количества и размеров всех компонентов клетки при условии наличия всех необходимых химических элементов, что приводит к увеличению ее массы. Питательные субстраты должны содержать эти элементы в метаболически доступной форме. Рост клетки не беспреде­лен. После достижения критических размеров клетка подвергается делению или размножению.

Большинство бактерий делится поперечным бинарным делением или цитокинезом. У большинства грамположительных бак­терий деление происходит путем синтеза попе­речной перегородки, идущей от периферии к центру. Клетки большинства грамотрицательных бактерий делятся путем перетяжки. Процесс деления повторяется через приблизительно равные промежутки времени (от нескольких минут до нескольких суток), что является индивидуальной генетической характеристикой микробного вида. В результате размножения резко увеличивается количество клеток в популяции.

Размножение или репродукция у бактерий - это разделение суперспирализованной ДНК нуклеоида на две дочерние нити, каждая из которых далее достраивается комплементарной нитью и одновременно происходит образование двух дочерних клеток (полуконсервативный способ).

Размножение характеризуется временем генерации (интервал времени, за который число клеток удваи­вается) и таким понятием, как концентрация бактерий (число клеток в 1 мл).

При внесении бактерий в питательную сре­ду они растут и размножаются до тех пор, пока содержание какого-нибудь из необхо­димых компонентов среды не достигнет ми­нимума, после чего рост и размножение пре­кращаются. Если на протяжении всего этого времени не прибавлять питательных веществ и не удалять конечных продуктов обмена, то получаем статическую бактериальную куль­туру. Статическая (периодическая) культура бактерий ведет себя как многоклеточный ор­ганизм, с генетическим ограничением роста. Если построить график, по оси абсцисс кото­рого отложить время, а по оси ординат - чис­ло клеток, то получим кривую, описывающую зависимость числа образующихся клеток от времени размножения, которая называется кривой роста.

Кривая роста бактерий в питательной среде. На этой кривой можно различить не­сколько фаз, сменяющих друг друга в опреде­ленной последовательности (рис. 11):

1. Начальная - лаг-фаза (англ. lag - отставать). Охватывает промежуток времени между посевом бактерий и на­чалом размножения. Ее продолжительность составляет в среднем 2-5 ч и зависит от со­става питательной среды, от возраста засевае­мой культуры. Во время лаг-фазы происходит адаптация бактериальных клеток к новым условиям культивирования, идет синтез индуцибельных ферментов.

2. Экспоненциальная (логарифмичес­кая) фаза. Характеризуется постоянной мак­симальной скоростью деления клеток, фаза геометрического роста с резким ростом численности популяции микроорганизмов (2 в степеии n). Скорость размножения зависит от вида бактерий и пита­тельной среды. Время удвоения клеток называется временем генерации, которое варьирует от вида бактериальной культуры: у бакте­рий рода Pseudomonas оно равняется 14 мин, а у Mycobacterium 18 - 24 ч. Величина клеток и содержание белка в них во время экспо­ненциальной фазы остаются постоянными. Бактериальная культура в этой фазе состоит из стандартных клеток.

Рис. 11. Фазы размножения бактерий

3. Стационарная фаза (фаза равновесия размножения и гибели микробных клеток). Наступает тогда, когда число клеток перестает увеличиваться. Так как скорость роста зависит от концентра­ции питательных веществ, то при уменьше­нии содержания последних в питательной сре­де уменьшается и скорость роста. Снижение скорости роста происходит также из-за боль­шой плотности бактериальных клеток, сни­жения парциального давления кислорода, накопления токсических продуктов обмена. Продолжительность стационарной фазы со­ставляет несколько часов и зависит от вида бактерий и особенностей их культивирования.

4. Фаза отмирания или гибели - уменьшение численности популяции в связи с уменьшением и отсутствием условий для размножения микроорганизмов. Наступает вследствие накопления кислых продуктов обмена или в результате аутолиза под влиянием собствен­ных ферментов. Продолжительность этой фа­зы колеблется от десятка часов до нескольких недель.

Данная динамика характерна для периодических культур с постепенным истощением запаса питательных веществ и накоплением метаболитов. Постоянное нахождение бактериальной популяции в логарифмической фазе роста наблюдается в непрерывной культуре, что до­стигается постепенным дозированием пос­тупления питательных веществ, контролем плотности бактериальной суспензии и удале­нием метаболитов. Такой процесс выращивания микроорганизмов называется проточным культивированием (непрерывная культура). Рост в непрерывной культуре позволяет получать большие массы бактерий при проточном культивировании в специаль­ных устройствах (хемостатах и турбидистатах) и используется при производстве вакцин, а также в биотехнологии для полу­чения различных биологически активных веществ, продуци­руемых микроорганизмами.

Жизнедеятельность бактерий характеризуется ростом - фор­мированием структурно-функциональных компонентов клетки и увеличением самой бактериальной клетки, а также размноже­нием - самовоспроизведением, приводящим к увеличению ко­личества бактериальных клеток в популяции.

Бактерии размножаются путем бинарного деления пополам, реже путем почкования. Актиномицеты, как и грибы, могут раз­множаться спорами. Актиномицеты, являясь ветвящимися бактериями, размножаются путем фрагментации нитевидных клеток. Грамположительные бактерии делятся путем врастания синтези­рующихся перегородок деления внутрь клетки, а грамотрицательные - путем перетяжки, в результате образования гантелевид-ных фигур, из которых образуются две одинаковые клетки.

Делению клеток предшествует репликация бактериальной хро­мосомы по полуконсервативному типу (двуспиральная цепь ДНК раскрывается и каждая нить достраивается комплементарной ни­тью), приводящая к удвоению молекул ДНК бактериального ядра - нуклеоида.

Репликация ДНК происходит в три этапа: инициация, элон­гация, или рост цепи, и терминация.

Размножение бактерий в жидкой питательной среде. Бактерии, засеянные в определенный, не изменяющийся объем питатель­ной среды, размножаясь, потребляют питательные элементы, что приводит в дальнейшем к истощению питательной среды и пре­кращению роста бактерий. Культивирование бактерий в такой си­стеме называют периодическим культивированием, а культуру - периодической. Если же условия культивирования поддерживаются путем непрерывной подачи свежей питательной среды и оттока такого же объема культуральной жидкости, то такое культивиро­вание называется непрерывным, а культура - непрерывной.

При выращивании бактерий на жидкой питательной среде наблюдается придонный, диффузный или поверхностный (в виде пленки) рост культуры. Рост периодической культуры бактерий, выращиваемых на жидкой питательной среде, подразделяют на несколько фаз, или периодов :

1. лаг-фаза;

2. фаза логарифмического роста;

3. фаза стационарного роста, или максимальной концентрации

бактерий;

4. фаза гибели бактерий.

Эти фазы можно изобразить графически в виде отрезков кри­вой размножения бактерий, отражающей зависимость логариф­ма числа живых клеток от времени их культивирования.

Лаг-фаза - период между по­севом бактерий и началом размножения. Продолжительность лаг-фазы в среднем 4-5 ч. Бактерии при этом увеличиваются в раз­мерах и готовятся к делению; нарастает количество нуклеино­вых кислот, белка и других компонентов.

Фаза логарифмического (экспоненциального) роста является периодом ин­тенсивного деления бактерий. Продолжительность ее около 5- 6 ч. При оптимальных условиях роста бактерии могут делиться каждые 20-40 мин. Во время этой фазы бактерии наиболее ра­нимы, что объясняется высокой чувствительностью компонен­тов метаболизма интенсивно растущей клетки к ингибиторам синтеза белка, нуклеиновых кислот и др.

Затем наступает фаза стационарного роста , при которой количество жиз­неспособных клеток остается без изменений, составляя макси­мальный уровень (М-концентрация). Ее продолжительность вы­ражается в часах и колеблется в зависимости от вида бактерий, их особенностей и культивирования.

Завершает процесс роста бактерий фаза гибели , характеризующаяся отмиранием бак­терий в условиях истощения источников питательной среды и накопления в ней продуктов метаболизма бактерий. Продолжи­тельность ее колеблется от 10 ч до нескольких недель. Интен­сивность роста и размножения бактерий зависит от многих фак­торов, в том числе оптимального состава питательной среды, окислительно-восстановительного потенциала, рН, температуры и др.

Размножение бактерий на плотной питательной среде. Бактерии, растущие на плотных питательных средах, образуют изолирован­ные колонии округлой формы с ровными или неровными кра­ями (S- и R-формы), различной консистенции и цве­та, зависящего от пигмента бактерий.

Пигменты, растворимые в воде, диффундируют в питатель­ную среду и окрашивают её. Дру­гая группа пигментов нерастворима в воде, но растворима в орга­нических растворителях. И, нако­нец, существуют пигменты, не растворимые ни в воде, ни в органических соединениях.

Наиболее распространены среди микроорганизмов такие пиг­менты, как каротины, ксантофиллы и меланины. Меланины яв­ляются нерастворимыми пигментами черного, коричневого или красного цвета, синтезирующимися из фенольных соединений. Меланины наряду с каталазой, супероксидцисмутазой и пероксидазами защищают микроорганизмы от воздействия токсичных перекисных радикалов кислорода. Многие пигменты обладают ан­тимикробным, антибиотикоподобным действием.