ГУ НИИ питания РАМН, Москва

Охратоксин А - вторичный метаболит широко распространенных микроскопических плесневых грибов родов Penicillium (P. verrucosum) и Aspergillius (A. ochraceus) стоит в ряду приоритетных микотоксинов – контаминантов пищевых продуктов, и представляет реальную опасность для здоровья человека. Охратоксин А обладает выраженным нефротоксическим, канцерогененным, а также тератогененным, иммунотоксическим, нейротоксическим, генотоксическим и цитотоксическим действием . Международным агентством по исследованию рака (IARC) охратоксин А отнесен к веществам, возможно канцерогенным для человека (группа 2В) . При введении внутрь LD50 варьирует для разных видов животных от 20-30 мг/кг м. т. (для крыс) до 1 мг/кг м. т. (для свиней) . Охратоксин А рассматривается в качестве одного из этиологических факторов Балканской эндемической нефропатии - тяжелого почечного заболевания, регистрируемого в некоторых восточноевропейских странах (в частности Болгарии, Румынии, Сербии, Хорватии, Боснии и Герцеговине, Словении, Македонии) . Охратоксин А наиболее часто обнаруживается в зерновых продуктах, кофе, специях. В последнее время появляются данные о значительном загрязнении охратоксином А сухофруктов, вина и фруктовых соков. Так, в результате исследований, проведенных в странах ЕС, было установлено, что около 70% партий зерновых продуктов содержали охратоксин А в диапазоне от 0,00001 до 0,041 мг/кг, около 60% исследованных партий вина были загрязнены охратоксином А в количестве от 0,000003 до 0,016 мг/л . Особого внимания заслуживают данные о частом обнаружении охратоксина А в крови, а также материнском молоке населения многих европейских стран, что свидетельствует о постоянном поступлении этого микотоксина в организм человека . Основной вклад в величину поступления охратоксина А с продуктами питания вносят зерновые (44%), вино (10%) и кофе (9%) . Рекомендуемое Объединенным комитетом экспертов ФАО/ВОЗ по пищевым добавкам (JECFA) допустимое недельное потребление охратоксина А составляет 100 нг/кг/м. т. . Содержание охратоксина А в странах ЕС регламентируется на уровне 0,005 мг/кг в продовольственном сырье и 0,003 мг/кг в продуктах питания . Достоверные данные о загрязнении пищевых продуктов охратоксином А в РФ отсутствуют.

Разработанный ранее для нужд санитарно-эпидемиологической службы СССР метод определения охратоксина А в пищевых продуктах , использующий жидко-жидкостное распределение для очистки экстракта, имеет ряд недостатков: относительно низкая чувствительность метода (предел обнаружения - 0,001-0,002 мг/кг), значительная продолжительность анализа, а также необходимость использования большого количества хлорсодержащих органических растворителей.

К настоящему времени разработаны новые более эффективные методы определения охратоксина А в пищевых продуктах, основанные на применении твердофазной экстракции (ТФЭ) . Для ТФЭ характерна хорошая очистка экстракта, высокая степень извлечения и малый расход растворителей. При ТФЭ используют нормально-фазовую адсорбционную хроматографию на силикагеле , обращено - фазовую распределительную хроматографию на силикагеле, химически модифицированном октадецилсиланом , иммуноаффинную хроматографию , а также колоночную хроматографию на других сорбентах (диатомитовая земля (целит), полиамид, полимеры, полученные методом импринтинга и др.) .

Слабокислотные свойства (рКА = 4,4) охратоксина А (рис.1) определяют необходимость его экстракции либо в недиссоциированной форме смесями органических растворителей с кислотными водно-солевыми растворами , либо в виде соли - водными слабощелочными растворами, например, раствором гидрокарбоната натрия .

Обращенно-фазовая ВЭЖХ (ОФ ВЭЖХ) с флуориметрическим детектированием является наиболее широко распространенным методом определения охратоксина А в пищевых продуктах .

Целью исследования явилась разработка чувствительного метода обнаружения, идентификации и количественного определения охратоксина А в пищевых продуктах путем оптимизации аналитических подходов, основанных на использовании ТФЭ.

Экспериментальная часть

Аппаратура и реагенты. Хроматографическая система состояла из насоса высокого давления Jasco 880-PU, инжектора Rheodyne-7125 с объёмом петли-дозатора 20 мкл, флуориметрического детектора FL Detector model LC305 (Linear Instruments) (лвозб.=250 нм, лэмис.= 458 нм) и системы для сбора и обработки данных «Мультихром» (Амперсенд). Хроматографическая колонка (250 * 4,6 мм) с неподвижной фазой Kromasil C18 (MetaChem Technologies Inc.), с размером частиц 5 мкм.

Экстракцию проводили с использованием аппарата для встряхивания shaker s-3.08L (ELMI), для центрифугирования проб использовали центрифугу ЦЛС 31М. Твёрдофазную экстракцию проводили с использованием манифолда Macherey-Nagel, патронов ДИАПАК Силикагель (БиоХимМак СТ), иммуноаффинных колонок (ИАК) OCHRAPREP (R-BIOFARM RHONE LTD). рН растворов измеряли рН-метром МР 230 (Mettler Toledo). Концентрирование проб проводилось на роторном испарителя Laborota 4000 (Heidolph). Для растворения стандартов и упаренных экстрактов использовалась ультразвуковая ванна УЗВ-12л (ПКФ САПФИР). Для подбора оптимальных волн возбуждения и эмиссии использован флуоресцентный спектрофотометр Cary Eclipse (Varian). В качестве стандарта использовался стандартный образец охратоксина А в смеси бензол-уксусная кислота (99:1) с концентрацией С = 9,2 нг/мкл.

Твердофазная экстракция:

Очистка с помощью колоночной хроматографии (КХ) на диатомитовой земле. Экстракцию охратоксина А из 25,0 г. измельченной пробы проводили 125 мл хлороформа после добавления 20 мл 2% уксусной кислоты. Перемешивали на аппарате для встряхивания в течение 30 минут. 50 мл пропущенного через бумажный фильтр хлороформного экстракта наносили на колонку с диатомитовой землей, импрегнированной гидрокарбонатом натрия. Колонку промывали последовательно 70 мл гексана и 30 мл хлороформа. Охратоксин А элюировали с колонки 150 мл смеси бензол – – уксусная кислота (86:12:2). Элюат упаривали досуха, растворяли в 3 мл подвижной фазы (ацетонитрил – водная Н3РО4 (рН=2.6) (62:38) с использованием ультразвуковой ванны.

Очистка с помощью КХ на силикагеле. Экстракцию охратоксина А из 20,0 г. измельченной пробы проводили 100 мл толуола после последовательного добавления 30 мл 2М раствора соляной кислоты и 50 мл 0,4М раствора хлорида магния. Перемешивали 60 минут, центрифугировали со скоростью 3500 об./мин 5 минут. Верхний толуоловый слой фильтровали через бумажный фильтр, отбирая 50 мл фильтрата. После кондиционирования 10 мл толуола на патрон с силикагелем наносили 50 мл фильтрата, промывали дважды 10 мл н-гексана и 10 мл смеси толуол – ацетон (85:15), затем 5 мл толуола. Охратоксин А элюировали 40 мл смеси толуол – ацетон – уксусная кислота (89:10:1). Элюат упаривали досуха, растворяли в 1 мл подвижной фазы (ацетонитрил – водная Н3РО4 (рН=2.6) (62:38) с использованием ультразвуковой ванны.

Очистка с помощью иммуноаффинной КХ . Экстракцию охратоксина А из 50,0г. измельченной пробы проводили 200 мл смеси ацетонитрил – вода (60:40). Перемешивали в течение 30 минут. 4 мл пропущенного через бумажный фильтр экстракта смешивали с 44 мл фосфатного и наносили на иммуноаффинную колонку (ИАК), которую затем промывали 20 мл фосфатного буфера. Остатки фосфатного буфера удаляли продуванием ИАК воздухом. Охратоксин А элюировали 3 мл смеси метанол – уксусная кислота (98:2). Элюат упаривали досуха, растворяли в 1 мл подвижной фазы (ацетонитрил – водная Н3РО4 (рН=2.6) (62:38) с использованием ультразвуковой ванны.

Условия ВЭЖХ. Идентификацию и количественное определение охратоксина А проводили методом ОФ ВЭЖХ в режиме изократического элюирования с флуоресцентным детектированием (лвозб.=250 нм, лэмис.=458 нм). В качестве подвижной фазы использовали смесь ацетонитрил – водная Н3РО4 (рН=2.6) (62:38). Скорость элюирования составляла 1 мл/мин. В систему для ВЭЖХ вводилось 20 мкл исследуемого раствора.

Результаты и их обсуждение.

При очистке экстракта путем КХ с диатомитовой землей, импрегнированной гидрокарбонатом натрия, в качестве базового был использован метод АОАС 975.38 , предусматривающий применение ТСХ для идентификации и количественного определения охратоксина А. Нами в целях повышения чувствительности и специфичности метода была использована ОФ ВЭЖХ с флуоресцентным детектированием. В результате применения базового метода степень извлечения охратоксина А из матрикса, искусственно контаминированного охратоксином А на уровне 0,01 мг/кг, в наших условиях не превысила 40%. В целях повышения величины извлечения нами был внесен целый ряд изменений в условия экстракции и очистки: в состав экстрагирующей смеси была добавлена уксусная кислота; объем хлороформа, используемого для промывания колонки, уменьшен до 30 мл; в состав элюирующей смеси внесен ацетон; объем элюирующей смеси увеличен до 150 мл. В результате оптимизации метода величина извлечения охратоксина А из пшеницы возросла до 60% (табл.1).

Степень извлечения удалось существенно повысить, применив метод твердофазной экстракции на патронах с немодифицированным силикагелем (схема, приближенная к методу ICC № 000 ). Корректировка базового метода (увеличено содержание толуола в смеси толуол – ацетон, используемой для промывания колонки, до 85%, в состав элюирующей смеси внесен ацетон, объем элюирующей смеси доведен до 40 мл) позволила увеличить степень извлечения до 80%.

При использовании иммуноаффинной КХ наблюдалась максимальная степень извлечения охратоксина А из пищевого матрикса (до 100%), При этом предел обнаружения (0,0005 мг/кг) был выше, чем при очистке КХ на силикагеле (0,00005 мг/кг).

Для обнаружения, идентификации и количественного определения охратоксина А с помощью ВЭЖХ был подобран оптимальный состав подвижной фазы (ПФ) и уточнены длины волн возбуждения и эмиссии флуоресценции, обеспечившие максимальный сигнал и селективность при детектировании охратоксина А (табл.2). Подобранная длина волн возбуждения (250 нм вместо 333 нм) и эмиссии флуоресценции для оптимизированной подвижной фазы позволила повысить отношение сигнал/шум с соответствующим снижением предела обнаружения метода. Изменение состава ПФ позволило улучшить разделение пиков охратоксина А и компонентов матрикса пищевого продукта при одновременном снижении времени удерживания пика охратоксина А (рис.2).

Возможность использования разработанного нами модифицированного метода, основанного на применении патронов с силикагелем, в рутинном анализе охратоксина А была подтверждена выборочным исследованием частоты и уровня загрязнения этим микотоксином основных видов продовольственного сырья. Для этого было изучено продовольственное зерно урожая 2004 года из различных регионов РФ (табл.3). Девять из 46 исследованных образцов зерна содержали охратоксин А в диапазоне от 0,00005 до 0,005 мг/кг, что не превышало регламенты, принятые в странах ЕС.

Таким образом, путем оптимизации существующих аналитических подходов предложены два варианта метода обнаружения, идентификации и количественного определения охратоксина А в пищевых продуктах: с использованием КХ на силикагеле или иммуноаффинной КХ для очистки экстрактов и оптимизированных условий ВЭЖХ. Метод, основанный на применении КХ на силикагеле, отличается низким пределом обнаружения и невысокой стоимостью расходных материалов. Очистка с помощью иммуноаффинной КХ обеспечивает высокую степень извлечения и чистоту экстракта, а также характеризуется более высоким пределом обнаружения (0,0005 мг/кг вместо 0,00005 мг/кг для варианта с очисткой КХ на силикагеле). Полученные в результате проведенного выборочного исследования содержания охратоксина А в продовольственном сырье данные свидетельствуют о необходимости дальнейшего изучения загрязнения охратоксином А продуктов питания в целях оценки риска контаминации этим микотоксином пищевых продуктов для здоровья населения РФ.

ГУ НИИ питания РАМН

109240, Москва, Устьинский проезд, д.2/14

I. V. Aksenov, K. I. Eller, V. A. Tutelyan

Optimization of analytical methods for ochratoxin A analysis in food.

Ochratoxin A is a mycotoxin produced by widely distributed Aspergillus and Penicillium species. The mycotoxin is a common contaminant of cereals, coffee, wine, dried fruits and spices. Ochratoxin A has been shown to be nephrotoxc, immunosuppressive, embryotoxic, teratogenic and carcinogenic in many mammalian species. Codex Alimentarius and EC have established maximum permissible level of 5 мg/kg for ochratoxin A in raw cereal grains and of 3 мg/kg – for ready-to-eat products derived from cereals. Two simple and reliable modifications of methods have been developed for the analysis of ochratoxin A in food which are based on immunoaffinity or silica gel column clean-up and HPLC with fluorescence detection. The detection limits were 0,5 мg/kg and 0,05 мg/kg respectively. Methods have been used successfully to analyze ochratoxin A in 46 samples of raw cereals harvested in different regions of Russia. Nine samples were found to be contaminated with ochratoxin A on levels ranged from 0,05 to 5 мg/kg.

Оптимизация аналитических методов обнаружения, идентификации и количественного определения охратоксина А в пищевых продуктах.

Охратоксин А – микотоксин, продуцируемый широко распространенными плесневыми грибами родов Aspergillius и Penicillium. Он является частым контаминантом зерновых продуктов, кофе, вина, сухофруктов и специи. Доказано нефротоксическое, иммуносупрессивное, эмбриотоксическое, тератогенное и канцерогенное действие охратоксина А для многих видов млекопитающих. Установленный Кодексом Алиментариус и ЕС максимальный допустимый уровень содержания охратоксина А в зерне равен 5 мкг/кг, в готовых к употреблению зерновых продуктах – 3 мкг/кг. Предложены два оптимизированыx метода обнаружения, идентификации и количественного определения охратоксина А в пищевых продуктах: с использованием КХ на силикагеле или иммуноаффинной КХ для очистки экстрактов и ВЭЖХ с флуоресцентной детекцией. Предел обнаружения составил соответственно 0,05 и 0,5 мкг/кг. Разработанные методы использованы для анализа содержания охратоксина А в 46 образцах зерна, собранного в различных регионах России. Девять образцов были загрязнены охратоксином А в количестве от 0,05 до 5 мкг/кг.

Подписи к рисункам.

Рисунок 1. Химическая структура охратоксина А.

Рисунок 2. Хроматограммы образца пшеницы, контаминированного охратоксином А на уровне 0,01 мг/кг, при различных способах очистки:

А) КХ на диатомитовой земле Б) КХ на силикагеле В) иммуноаффинная КХ.

Таблица 1. Сравнительная характеристика различных способов очистки экстракта.

Таблица 2. Сравнительная характеристика параметров ВЭЖХ (для 1 нг охратоксина А во вколе).

Таблица 3. Выборочное исследование уровня загрязнения охратоксином А продовольственного зерна урожая 2004 г.

Литература

Листовка

Наборы и представляют собой тест-системы для иммуноферментного анализа. Они выпускаются серийно в соответствии с ISO 9000 в комплекте с необходимыми реагентами и предназначены для количественного определения охратоксина в зерновых культурах, кормах, зерновых продуктах, пиве и сыворотке крови. Методические указания по использованию тест-систем RIDASCREEN ® FAST Ochratoxin А и RIDASCREEN ® Ochratoxin A утверждены Управлением ветеринарии Федерального агентства по сельскому хозяйству Минсельхоза России за номером МУК 5-1-14/1001. Системы включены в "Перечень нормативной документации, разрешенной для использования в государственных ветеринарных лабораториях при диагностике болезней животных, рыб, пчел, а также контроля безопасности сырья животного и растительного происхождения". Тест-системы RIDASCREEN ® FAST Ochratoxin А соответствуют ГОСТ 34108-2017 "Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Определение содержания микотоксинов прямым твердофазным конкурентным иммуноферментным методом".

Определение охратоксина А в зерне, кормах, зерновых продуктах, пиве и сыворотке крови

Охратоксин - это ядовитое вещество, образующееся в результате жизнедеятельности плесневых грибов рода Aspergillus и Penicillium . Наряду с выраженной нефротоксичностью, охратоксин обладает гепатотоксичностью, тератогенными, канцерогенными и иммунодепрессивными свойствами. С продуктами растительного и животного происхождения охратоксин может попадать в организм человека. Он обнаруживается не только в зерновых культурах (13% положительных проб) и кормах для животных, но и в свиной крови (60% положительных проб) и почках (21% положительных проб).

Технический Регламент Таможенного Союза ТР ТС 021/2011 "О безопасности пищевой продукции" регламентируют следующий предельный уровень содержания охратоксина А: в продовольственном зерне, крупе, муке - 0,005 мг/кг (5 мкг/кг); в детском питании, продуктах питания для дошкольников и школьников, продуктах для питания беременных и кормящих женщин — не допускается (<0,0005 мг/кг).

Проект федерального закона № 349084-5 "Технический регламент на винодельческую продукцию" устанавливает требования к содержанию в вине охратоксина А не более 0,002 мг/л.

В проект Федерального закона "О требованиях к безопасности пищевых продуктов и процессов их производства, хранения, перевозки, реализации и утилизации" также включено требование обязательного контроля продовольственного зерна на охратоксин А, содержание которого не должно превышать 0,005 мг/кг. С актуальными законодательными нормативами можно ознакомиться на сайте compact24.com .

До недавнего времени для контроля охратоксина применялись преимущественно хроматографические методы (высокоэффективная жидкостная хроматография, тонкослойная хроматография). Значительно более удобен метод иммуноферментного анализа (ELISA, или ИФА), обладающий очень высокой чувствительностью.

Смежные продукты:

Охратоксины вырабатываются некоторыми видами грибов Aspergillus и Penicillium . Основными продуцентами являются A.ochraceus и P.viridicatum . Эти грибы встречаются повсеместно. Aspergillus вырабатывает охратоксины при повышенной температуре и влажности, а Penicillium уже при 5ºС. Охратоксины – соединения высокой токсичности, с ярко выраженным тератогенным эффектом.

Охратоксины А,В, и С представляют собой группу близких по структуре соединений, являющихся изокумаринами, связанными с L -фенилаланином пептидной связью. В зависимости от природы радикалов образуются охратоксины различных типов (табл. 2.3.).

Охратоксин А – бесцветное кристаллическое вещество, слабо растворимое в воде, умеренно растворимое в полярных органических растворителях (метанол, хлороформ), а также в водном растворе карбоната натрия. В химически чистом виде он нестабилен и очень чувствителен к воздействию света и воздуха, однако в растворе этанола может сохраняться без изменений в течение длительного времени. В УФ свете обладает зеленой флуоресценцией.

Охратоксин В – кристаллическое вещество, аналог охратоксина А, не содержащий атом хлора. Он примерно в 50 раз менее токсичен, чем охратоксин А. В УФ-свете обладает голубой флуоресценцией.

Охратоксин С – аморфное вещество, этиловый эфир охратоксина А, близок к нему по токсичности, но в качестве природного загрязнителя пищевых продуктов и кормов не обнаружен. В У-свете обладает бледно-зеленой флуоресценцией.

Охратоксины принадлежат к токсичным микотоксинам, обладают высокой токсичностью для печени, почек, тератогенными и иммунодепрессивными свойствами, выраженным гемолитическим эффектом. Из охратоксинов наиболее токсичен охратоксин А (ЛД 50 = 3,4 мг/кг, (однодневные цыплята, перорально)). Он более токсичен, чем афлатоксины. Другие микотоксины этой группы на порядок менее токсичны.

Биохимические, молекулярные, клеточные механизмы действия охратоксинов изучены недостаточно. Известно, что охратоксин А подавляет синтез протеина и метаболизм углеводов, в частности гликоногеноз, путем ингибирования активности фенилаланин – т-РНК – специфического фермента, играющего ключевую роль в начальной стадии синтеза протеина.

Охратоксин А обнаружен в кукурузе, ячмене, пшенице, овсе, ячмене. Важен и опасен тот факт, что при высоком загрязнении кормового зерна и комбикормов охратоксин А обнаруживается в животноводческой продукции (ветчина, бекон, колбасы). Охратоксин В встречается редко. Охратоксины также поражают все плоды садово-огородных культур. Особенно сильно поражаются яблоки: до 50% урожая может загрязняться микотоксинами.

Следует отметить, что охратоксины являются стабильными соединениями. Так, например, при длительном прогревании пшеницы, загрязненной охратоксином А, его содержание снижалось лишь на 32% (при температуре 250–300ºС). Таким образом, распространненость в продуктах питания, токсичность и устойчивость охратоксинов создают реальную опасность для здоровья человека.

Методы анализа

Охратоксин А содержится в окисленных продуктах. Он легко растворяется во многих органических растворителях, что используется для экстракции. Наиболее часто используется экстракция хлороформом и водным раствором фосфорной кислоты с последующей очисткой на колонке и количественное определение с использованием метода ТСХ.

Разработан также метод ВЭЖХ. Перед ВЭЖХ анализом образец готовят следующим образом. Измельченный образец обрабатывают смесью 2 М соляной кислоты и 0,4 М раствора хлорида магния. После гомогенизации экстрагируют толуолом в течение 60 мин. Смесь центрифугируют. Центрифугат пропускают через колонку с силикагелем и промывают смесью толуола с ацетоном (подвижная фаза). Охратоксин А элюируется смесью толуола с уксусной кислотой (9:1) и высушивается при 40°С. Остаток растворяют и фильтруют. Анализ проводят с использованием ВЭЖХ.

Кроме того, разработан ряд биопроб на креветках, бактериях, но полученные результаты не позволили использовать эти методы для определения охратоксинов.

Концентрация охратоксина А в пробе, мг/кг

Границы относительной погрешности (показатель точности) (±d ), %, Р = 0,95

Стандартное отклонение повторяемости (s r ), %

Предел повторяемости (r ), %

Полнота извлечения веществ, %

4. Средства измерений, вспомогательные устройства, посуда, реактивы и материалы

4.1 . Средства измерений

4.2 . Вспомогательное оборудование

4.3 . Реактивы и материалы

. Подготовка к выполнению измерений

5.1 . Приготовление стандартных растворов охратоксина А

Для приготовления стандартного раствора хранения (концентрация охратоксина А - 10 нг/мкл) навеску кристаллического охратоксина А массой 5 мг помещают в мерную колбу объемом 500 см 3 , приливают 50 см 3 смеси толуол-уксусная кислота (98:2 % об.), тщательно перемешивают до полного растворения вещества и доводят той же смесью растворителей до метки. Для установления точной концентрации раствора хранения измеряют его оптическую плотность при длине волны 333 нм (Д 333). Концентрацию раствора вычисляют по формуле:

Далее 5 см 3 стандартного раствора охратоксина А с концентрацией 10 нг/мкл разбавляют смесью толуол-уксусная кислота (98: 2 % об.) до объема 100 см 3 , получая рабочий раствор с концентрацией 0,5 нг/мкл.

Для приготовления рабочих растворов охратоксина А с концентрацией 0,005; 0,05 и 0,1 нг/мкл отбирают соответственно 50, 500 и 1000 мкл раствора с концентрацией 0,5 нг/мкл, упаривают досуха и растворяют в 5 см 3 подвижной фазы.

Раствор хранения охратоксина А содержат в стеклянной посуде с притертой пробкой в темном прохладном месте (при температуре около 0 °С) до одного года и используют для приготовления рабочих стандартных растворов. Рабочие стандартные растворы хранят в вайлах из темного стекла в темном прохладном месте (при температуре около 0 °С) в течение 1 месяца.

Перед использованием рабочих стандартных растворов их следует довести до комнатной температуры и только после этого следует открывать пробки.

5.2 . Приготовление фосфатного буферного раствора, рН = 7,4

Навеску натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного массой 1,15 г, навеску натрия однозамещенного 2-водного массой 0,124 г и навеску натрия хлорида массой 1,74 г переносят в мерную колбу вместимостью 100 см 3 , добавляют 10 - 20 см 3 дистиллированной воды. Перемешивают и доводят объем раствора в колбе до метки. Срок хранения - 1 месяц в холодильнике.

5.3 . Приготовление смесей растворителей

Толуол -уксусная кислота (98:2 % об .).

В мерную колбу на 1000 см 3 вносят 20 см 3 уксусной кислоты и, перемешивая, доводят толуолом до метки. Срок хранения - 1 месяц в темном прохладном месте.

Ацетонитрил -вода (60:40 % об .).

В мерную колбу на 1000 см 3 вносят 600 см 3 ацетонитрила и, перемешивая, доводят водой до метки. Срок хранения - 1 месяц в темном прохладном месте.

Ацетонитрил -вода (60:40 % об .; рН = 3 ,0 ).

В мерную колбу на 1000 см 3 вносят 600 см 3 ацетонитрила и, перемешивая, доводят бидистиллированной водой до метки. Внесением фосфорной кислоты подводят рН смеси до величины, равной 3,0. Срок хранения - 1 месяц в темном прохладном месте.

Метанол -уксусная кислота (98:2 % об .).

В мерную колбу на 1000 см 3 вносят 20 см 3 уксусной кислоты и, перемешивая, доводят метанолом до метки. Срок хранения - 1 месяц в темном прохладном месте.

. Отбор и подготовка проб для анализа

6.1 . Отбор проб

Для учета специфики отбора проб отдельных видов продуктов следует руководствоваться действующей нормативно-технической документацией:

«Зерно. Правила приемки и методы отбора проб» ГОСТ 13586.3-83 ;

«Крупа. Правила приемки и методы отбора проб» ГОСТ 26312.1-84 ;

«Мука и отруби. Приемка и методы отбора проб» ГОСТ 27668-88 ;

«Продукты пищевые консервированные. Отбор проб и подготовка их к испытанию» ГОСТ 8756.0-70 .

Пробы для анализа, представительные по концентрации микотоксинов для всей партии, следует отбирать из предварительно гомогенизированного среднего (исходного) образца массой 2 кг.

6.2 . Подготовка проб для анализа

Отобранные пробы измельчают в течение 1 - 2 мин в лабораторной мельнице. При этом используют две параллельные пробы.

6.2.1 . Экстракция

Навеску 25 г измельченной пробы помещают в плоскодонную коническую колбу на 250 см, добавляют 100 см 3 смеси ацетонитрил-вода (60:40 % об.). Экстрагируют на аппарате для встряхивания проб в течение 30 мин. Полученную смесь фильтруют через бумажный складчатый фильтр «синяя лента». Отбирают 10 см 3 фильтрата и добавляют 90 см фосфатного буферного раствора, рН = 7,4.

6.2.2 . Очистка экстракта

На иммуноаффинную колонку наносят 100 мл полученной смеси со скоростью 1 - 2 капли в секунду, промывают 20 см 3 фосфатного буферного раствора, рН = 7,4. Охратоксин А элюируют 3 см 3 смеси метанол-уксусная кислота (98: 2 % об.).

. Выполнение измерений

7.1 . Приготовление тестового образца

Элюат упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 400 мкл подвижной фазы (раствор А).

7.2 . Условия хроматографирования

Условия ВЭЖХ: подвижная фаза - ацетонитрил-вода (60:40 % об.; рН = 3,0); скорость подвижной фазы - 1,5 см 3 /мин.

Флуориметрический детектор устанавливают на длину волны возбуждающего излучения 333 нм, на линии эмиссии устанавливают эмиссионный фильтр с полосой пропускания 466 нм.

Для анализа проб в инжектор хроматографа вводят с помощью микрошприца 50 мкл тестового образца (раствора А). При наличии пика, совпадающего по времени удерживания с охратоксином А, рассчитывают массу охратоксина А во вколе с помощью градуировочного графика.

. Обработка результатов измерения

8.1 . Построение градуированной зависимости

Для построения градуировочного графика проводят хроматографический анализ серии рабочих растворов стандартов. В инжектор с помощью микрошприца вводят 50 мкл рабочего раствора стандарта с концентрацией 0,005 нг/мкл, что соответствует 0,25 нг охратоксина А. Подобное делается для других стандартных растворов с концентрациями 0,05 и 0,10 нг/мкл, что в свою очередь соответствует 2,5 и 5,0 нг охратоксина А во вколе. В указанных условиях время удерживания находится для охратоксина А в диапазоне от 4 до 5 мин. На основании полученных данных строят градуировочный график (зависимость площади хроматографического пика от массы охратоксина А во вколе).

8.2 . Оформление результатов

Расчет концентрации охратоксина А в пробе проводится по формуле:

С (охр. А) - концентрация охратоксина А в пробе, мг/кг;

М - масса навески для анализа, г (25,0);

т - масса охратоксина А, соответствующая введенному в хроматограф объему раствора А, нг;

V 1 - объём раствора для экстракции, см 3 (100);

D - граница абсолютной погрешности:

d - граница относительной погрешности методики (показатель точности), % (табл. 1).

Если содержание охратоксина А в пробе менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

* 0,0001 мг/кг - предел обнаружения.

8.3 . Проверка приемлемости результатов параллельных определений

Допустимое расхождение между параллельными измерениями (R ) определяют на основании предела повторяемости (r ) (табл. 1):

R = 0,01 (r , %) × , мг/кг

Если расхождение между параллельными определениями не превышает допустимого:

то среднее арифметическое принимают за результат анализа.

При превышении норматива R следует повторить измерения, используя резервные пробы.

. Контроль качества результатов измерений

Периодичность контроля погрешности измерений зависит от количества рабочих измерений за контролируемый период и определяется планами контроля.

Образцами контроля являются рабочие пробы продовольственного сырья и пищевых продуктов. Отбирают пробу и разделяют ее на 2 равные части. Одну из них оставляют без изменений, а к другой добавляют такое количество раствора стандарта охратоксина А, чтобы его массовая доля в пробе по сравнению с исходным значением увеличилась на 50 - 100 %. Добавка должна вводиться в пробу перед началом пробоподготовки.

Обе пробы анализируют в точном соответствии с прописью методики и получают результаты анализа исходной пробы (С (отр.А) ) и пробы с добавкой (С ¢ (отр.А) ). Определение проводят в одинаковых условиях, а именно: анализ проводит один аналитик, с использованием одного набора мерной посуды, реактивов, растворов и т, д.

Алгоритм проведения оперативного контроля погрешности с использованием метода добавок состоит в сравнении результата контрольного определения, равного разности между результатом контрольного измерения пробы с добавкой (С ¢ (охр.А) ), пробы без добавки (С (охр.А) ) и величиной добавки (С доб(охр.А) ) с нормативом оперативного контроля (K ). Решение об удовлетворительной погрешности принимается при выполнении следующего условия (при Р и

Температура окружающего воздуха от 15 до 25 °С.

Относительная влажность воздуха не более 80 % при 25 °С.

Атмосферное давление 730 - 760 мм рт.ст.

Напряжение электропитания: 210 - 220 В. Частота переменного тока: 45 - 50 Гц.

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ, МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ

INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION, METROLOGY AND CERTIFICATION

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ

СТАНДАРТ

ВИНО И ВИНОМАТЕРИАЛЫ

Определение содержания охратоксина А методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Издание официальное

Стандартинформ

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены»

Сведения о стандарте

1 РАЗРАБОТАН Обществом с ограниченной ответственностью «Люмэкс-маркетикг» (ООО «ЛюмэкС"Маркетинг»)

2 ВНЕСЁН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (Росстаидарт)

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 18 июня 2015 г. Ne 47)

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 21 июля 2015 г. № 948-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 33287-2015 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2017 г.

5 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информаций об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок - в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе кНациональные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

© Стандартинформ. 2016

В Российской Федерации настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ВИНО И ВИНОМАТЕРИАЛЫ

Определение содержания охратоксика А методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Wine and wine materials.

Determination of ochratoxin A content by high performance liquid chromatography

Дата введения - 2017-01-01

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на вино и еиноматериалы и устанавливает метод определения массовой концентрации охратоксина А при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее - ВЭЖХ).

Диапазон измерений массовой концентрации охратоксина А составляет от 0.001 до 0.1 мг/дм 3 .

8 настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.010-76 Система стандартов безопасности труда. Взрывобезоласность. Общие требования

ГОСТ 12.1.019-79 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ 61-75 Кислота уксусная. Технические условия

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-63. ИСО 4788-60) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ ISO 3696-2013 Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы контроля

ГОСТ 4233-77 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия ГОСТ 4204-77 Реактивы. Кислота серная. Технические условия

ГОСТ ИСО 5725*6-2003° Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия ГОСТ 9293-74 (ИСО 2435-73) Азот газообразный и жидкий. Технические условия ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия ГОСТ ИСО/МЭК 17025-2009 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные. Типы. Основные параметры и размеры ГОСТ 29227-91 (ИСО 835*1-61) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

ГОСТ 31730-2012 Продукция винодельческая. Правила приемки и методы отбора проб ГОСТ OIML R 76-1-2011 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов е информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному

"" В Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 «Точность {правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике».

указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты)» за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Отбор и подготовка пробы к испытанию

Отбор проб по ГОСТ 31730.

Вина с повышенным содержанием диоксида углерода предварительно дегазируют. Для этого 50 см 3 продукта помещают в колбу с тубусом вместимостью 100 см 3 (см. 6.22), встряхивают и подключают к вакуумному насосу (см. 6.6). Дегазируют в течение 10-15 мин до исчезновения пены и появления больших пузырей на поверхности жидкости.

4 Требования безопасности

При проведении измерений следует соблюдать требования:

Электробеэопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019 и технической документации на хроматограф:

Еэрыеобезоласности в соответствии с ГОСТ 12.1.010;

Пожарной безопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.004;

Безопасности при работе с вредными веществами в соответствии с ГОСТ 12.1.007.

ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ - Охратоксин А вызывает поражение почек и печени и

предположительно является канцерогеном. Все работы, связанные с подготовкой пробы и приготовлением растворов охратоксина А, следует проводить в вытяжном шкафу с использованием защитной одежды, перчаток и защитных очков. Деконтаминацию стеклянной посуды, контактировавшей с охратоксином А, проводят 4 %-ным раствором гипохлорита натрия.

5 Сущность метода

Метод основан на экстракции охратоксина А из пробы подкисленным хлористым метиленом, концентрировании полученного экстракта, скрининге проб и определении массовой концентрации охратоксина А с применением ВЭЖХ на обращеннскразовой колонке с флуориметрическим детектированием.

6 Средства измерений, вспомогательное оборудование, стандартные образцы, реактивы, посуда и материалы

6.1 Хроматограф жидкостный с флуориметрическим или спсктрофлуоримстричсским детектором, обеспечивающим возбуждение флуоресценции в спектральной области (330 ± 20) нм и регистрацию интенсивности флуоресценции в спектральной области (465 ± 20) нм. Применяемый детектор должен обеспечивать предел обнаружения охратоксина А не более 5 нг/см 3 .

6.2 Весы неавтоматического действия по ГОСТ OIML R 76-1 с пределами допускаемой абсолютной погрешности не более ± 0.01 г.

6.3 Колонка хроматографическая аналитическая, заполненная обращенно-фаэоеым сорбентом с размером частиц 5 мкм. имеющая эффективность не менее 5000 теоретических тарелок по пику охратоксина А"\

6.4 Предколонка того же внутреннего диаметра и заполненная тем же обращенно-фаэоеым сорбентом, что и аналитическая колонка.

6.5 Испаритель ротационный, снабженный водяной баней с регулятором температуры в диапазоне от 20 “С до 50 °С.

6.6 Насос лабораторный вакуумный, мембранный или водоструйный по ГОСТ 25336, обеспечивающий разрежение от 2.5 до 10 кПа.

0 Пример коммерческого продукта, удовлетворяющего указанным требованиям. - хроматографическая колонка внутренним диаметром 2.1 мм и длиной 120 мм. заполненная обращенно-фаэоеым сорбентом Кромасил С-18. Alltfcna С18 и др. с размером частиц 5 мкм. снабженная предкопонкой длиной 25 мм. Эта информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является поддержкой указанного продукта.

6.7 Шкаф сушильный, обеспечивающий температуру до 200 в С.

6.8 Холодильник бытовой по ГОСТ 16317.

6.9 Центрифуга лабораторная с частотой вращения не менее 5000 об/мин.

6.10 Межгосударственный или метрологически обеспеченный в национальной системе измерений государства, принявшего стандарт, государственный стандартный образец 1 " состава раствора охратоксина А в ацетонитриле массовой концентрации 50 мкг/см 3 с погрешностью аттестованного значения не более ± 2.5 мкг/см 3 . Допускается применение стандартных образцов состава раствора охратоксина А в других растворителях, что должно быть учтено при приготовлении исходного раствора по 7.3.1.

6.11 вода дистиллированная по ГОСТ 6709 или вода для лабораторного анализа степени чистоты 1 по ГОСТ ISO 3696.

6.12 Кислота уксусная по ГОСТ 61. ледяная.

6.13 Ацетонитрил для жидкостной хроматографии, оптическая плотность относительно дистиллированной воды при 200 нм не более 0.025, массовая доля воды не более 0.03 %.

6.14 Хлористый метилен для высокоэффективной жидкостной хроматографии по нормативным документам, действующим на территории государства, принявшего стандарт.

6.15 Кислота серная по ГОСТ 4204, х. ч. или ч. д. а.

8.16 Натрий хлористый по ГОСТ 4233. х. ч.

6.17 Пипетки градуированные 1-2-2-1. 1-2-2-2. 1-2*2*5, 1-2-2-10 или других типов и исполнений по ГОСТ 29227.

6.18 Цилиндры мерные 1-25-2.1-50-2,1-250-2 или других исполнений по ГОСТ 1770.

6.19 Колбы мерные 2-25-2. 2-50-2.2-100-2. 2-500-2 по ГОСТ 1770.

6.20 Колбы остродонные 0-10-14/23 и 0-50-14/23 по ГОСТ 25336.

6.21 Колбы плоскодонные П-1-50-29/32, П-1-10О-29/32. П-1-20О-29/32. П-1-250-29/32 или Кн-1-50-29/32. Кн-1-100-29/32. Кн-1 -250-29/32 по ГОСТ 25336.

6.22 Колбы с тубусом 2-100-19/26.2-250-29/32 по ГОСТ 25336.

6.23 Воронки делительные типа ВД исполнений 1 или 3 вместимостью 50 см 3 по ГОСТ 25336.

6.24 Воронки лабораторные типа В по ГОСТ 25336.

6.25 Фильтры бумажные «красная лента» по нормативным документам, действующим на территории государства, принявшего стандарт.

6.26 Стеклянные емкости вместимостью 25. 50. 250, 1000 см 3 с пришлифованными стеклянными, фторопластовыми или полиэтиленовыми пробками по нормативным документам, действующим на территории государства, принявшего стандарт.

6.27 Часы песочные или таймер по нормативным документам, действующим на территории государства, принявшего стандарт.

Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками не хуже вышеуказанных и вспомогательного оборудования, реактивов и материалов с техническими характеристиками не хуже вышеуказанных.

7 Подготовка к проведению испытания

7.1 Подготовка стеклянной посуды

Посуду для приготовления и хранения подвижной фазы обрабатывают только серной кислотой по 6.15 без применения других моющих средств, тщательно промывают водопроводной водой и ополаскивают дистиллированной водой.

Остальную стеклянную посуду обрабатывают горячей водой с моющим средством, тщательно ополаскивают дистиллированной водой и сушат в сушильном шкафу при температуре 105 X.

7.2 Приготовление вспомогательных растворов

7.2.1 Приготовление подвижной фазы

8 заранее подготовленную стеклянную емкость вместимостью 1000 см 3 с плотно закрывающейся пришлифованной стеклянной, фторопластовой или полиэтиленовой пробкой помещают 5 см 3 ледяной уксусной кислоты (см. 6.12), 215 см 3 ацетонитрила (см. 6.13) и 280 см 3 дистиллированной воды. Смесь тщательно перемешивают. При хранении подвижной фазы недопустимо использование резиновых или корковых пробок.

Срок хранения смеси при комнатной температуре - не более 1 мес.

Перед применением подвижную фазу дегазируют и фильтруют в соответствии с рекомендациями изготовителя хроматографа.

" В Российской Федерации - стандартный образец утвержденного типа.

7.2.2 Приготовление смеси хлористого метилена и уксусной кислоты в объемном соотношении 200:1

В плоскодонную колбу вместимостью 250 см 3 помещают 200 см 3 хлористого метилена (см. 6.14) и 1.0 см 3 ледяной уксусной кислоты (см. 6.12).

Срок хранения смеси при комнатной температуре в стеклянной емкости с пришлифованной стеклянной, фторопластовой или полиэтиленовой пробкой - не болев 1 мес.

7.2.3 Приготовление раствора хлористого натрия с массовой долей 20 %.

В плоскодонную колбу вместимостью 200 см 3 помещают 20 г хлористого натрия (см. 6.16), приливают 80 см 3 дистиллированной воды, тщательно перемешивают.

Срок хранения раствора при комнатной температуре - не более 3 мес.

7.3 Приготовление растворов охратоксина А

7.3.1 Приготовление исходного раствора охратоксина А с номинальным значением массовой концентрации 1 мкг/см 3

Пипеткой отбирают 1 см 3 стандартного образца состава раствора охратоксина А в ацетонитриле массовой концентрации 50 мкг/см 3 (см. 6.10). помещают в мерную колбу вместимостью 50 см 3 и доводят объем до метки ацетонитрилом (см. 6.13).

Срок хранения приготовленного раствора в холодильнике при температуре от 2 °С до 6 *С - не более 6 мес.

Фактическое значение массовой концентрации охратоксина А в исходном растворе (См, мкг/см 3) вычисляют по формуле

где Ссо - аттестованное значение массовой концентрации охратоксина А в стандартном образце по паспорту, мкг/см 3 ;

Vco - объем стандартного образца состава раствора охратоксина А. отобранный для приготовления исходного раствора, см 3 (1 см 3);

V^, - объем мерной колбы, использованной для приготовления исходною раствора, см 3 (50 см 3).

Примечание - При использовании стандартного образца состава раствора охратоксина А в других растворителях аликвоту (1 см 3 } упаривают до сухого остатка в вакууме при температуре водяной бани от 40 "С до 45 *С или в токе азота. Сухой остаток растворяют в 2 см 1 ацетонитрила и перемешивают в течение 1 мин. Затем полученный раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 см 3 и разбавляют до метки ацетонитрилом.

7.3.2 Приготовление раствора охратоксина А в подвижной фазе с номинальным значением массовой концентрации 50 нг/см }

В мерную колбу вместимостью 50 см 3 помещают 2.5 см 3 исходного раствора охратоксина А по 7.3.1 и доводят объем до метки подвижной фазой по 7.2.1.

Срок хранения полученного раствора в холодильнике при температуре от 2 е С до 6 и С - не более 3 мес.

Фактическое значение массовой концентрации охратоксина А в растворе (Со, нг/см 3) вычисляют по формуле

С„ = r ~, ; v ~ -10QQ. (2)

где См, - фактическое значение массовой концентрации охратоксина А в исходном растворе (см. 7.3.1), мкг/см 3 ;

Объем исходного раствора по 7.3.1. отобранный для приготовления данного раствора. см 3 (2.5 см 3);

Vo - объем мерной колбы, использованной для приготовления исходного раствора, см 3 (50 см 3);

1000 - коэффициент согласования размерности единиц массы.

7.3.3 Приготовление градуировочных растворов охратоксина А

Исходный раствор охратоксина А в ацетонитриле по 7.3.1 помещают в мерную колбу вместимостью 50 см 3 . Объем раствора охратоксина А должен соответствовал» требованиям таблицы 1.

Таблица 1

Содержимое колбы разбавляют до метки подвижкой фазой по 7.2.1 в соответствии с таблицей 1.

Срок хранения градуировочных растворов в холодильнике при температуре от 2 С С до 6 °С - не более семи дней.

Примечание - При необходимости, например для внесения добавки охрагоксина А в пробу (см. 8.2). допускается приготовление аналогичным способом растворов охратоксина А других концентраций.

Фактическое значение массовой концентрации охратоксина А в градуировочных растворах вычисляют по формуле (2). исходя из значений объемов исходного раствора по таблице 1.

Перед использованием растворы выдерживают до достижения комнатной температуры.

7.4 Подготовка хроматографа

Подготовку хроматографа к измерениям проводят в соответствии с руководством (инструкцией) по эксплуатации.

Устанавливают рабочие длины волн возбуждения и регистрации флуоресценции (см. 6.1). Объемную скорость подачи подвижной фазы и объем дозирования пробы задают в зависимости от типоразмеров колонки, руководствуясь указаниями изготовителя хроматографа и колонки. Например, для хроматографической колонки, приведенной в 6.3. рекомендуются значение объемной скорости 200 мм 3 /мин и объем петли крана-дозатора от 10 до 20 мм\ При наличии термостата колонок устанавливают температуру (25 ± 1) °С.

7.5 Градуировка хроматографа

Диапазон линейности градуировочной характеристики составляет от 5 до 100 нг/см*. В качестве образцов для градуировки хроматографа используют градуировочные растворы охратоксина А no 7.3.3.

Регистрируют по две хроматограммы каждого градуировочного раствора и, используя программное обеспечение к хроматографу, проводят градуировку хроматографа, устанавливая параметры градуировочной характеристики и время удерживания охратоксина А.

Рассчитывают коэффициент корреляции и отклонения рассчитанных значений массовой концентрации охратоксина А в каждой градуировочной точке от фактического значения в соответствии с процедурой приготовления градуировочных растворов (см. 7.3.3).

Градуировку считают приемлемой, если:

Коэффициент корреляции не менее 0.998:

Относительное отклонение рассчитанного значения массовой концентрации охратоксина А от фактического значения не более ± 10 %.

7.6 Контроль стабильности градуировочной характеристики

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят ежедневно перед началом работы.

8 качестве контрольного раствора используют раствор охратоксина А в подвижной фазе, приготовленный аналогично 7.3.3. Массовую концентрацию охратоксина А в контрольном растворе выбирают, исходя из предполагаемого содержания охратоксина А в испытуемых пробах: рекомендуется использование раствора охратоксина А массовой концентрации 20 нг/см э.

Регистрируют не менее двух хроматограмм контрольного раствора и идентифицируют пик охратоксина А по времени удерживания при ширине окна идентификации 5 %. внося при необходимости программную коррекцию времени удерживания пика, и при помощи градуировочной характеристики рассчитывают массовую концентрацию охратоксина А для каждого ввода.

Повторяемость значений времени удерживания и значений массовой концентрации охратоксина А проверяют по формулам

l^Z^lisO.05, (3)

где h и Гг - значения времени удерживания пика охратоксина А на первой и второй хроматограммах соответственно, мин:

f - среднеарифметическое значение /, и t 2 , мин.

я, _ »»*0Л7»

с.

где Сщ и Сл2 - массовые концентрации охратоксина А в контрольном растворе по первой и второй хроматограммам соответственно, нг/см 3 ;

С к - среднеарифметическое значений Cxi и С«. нг/см 3 .

Градуировочная зависимость признается стабильной, если выполняется условие где С - фактическое значение массовой концентрации охратоксина А в контрольном растворе, нг/см 3 -

Если условие (5) не выполняется, то процедуру контроля повторяют. Результаты повторного контроля считают окончательными, и градуировку хроматографа по 7.5 проводят заново.

7.7 Контроль холостой пробы

Испытание холостой пробы проводят перед испытанием исследуемых проб.

В колбу для упаривания помещают 15 см* смеси хлористого метилена и уксусной кислоты по

7.2.2 и упаривают в вакууме до сухого остатка, поместив колбу в водяную баню при температуре от 40 ’С до 45 ’С.

Сухой остаток растворяют в 0.5 см* подвижной фазы по 7.2.1. выдерживают не менее 5 мин и проводят хроматографический анализ полученного концентрата по 8.3. Если на хроматограмме присутствуют пики, по времени удерживания близкие к пику охратоксина А, то находят и устраняют причины загрязнения холостой пробы.

Примечание - Наиболее распространенной причиной неудовлетворительного результата контроля холостой пробы является недостаточная чистота хлористого метилена, который может быть загрязнен примесями, имеющими близкие к охратоксину А значения времени удерживания. Такой хлористый метилен необходимо заменить или подвергнуть тщатегъной перегонке, собирая среднюю фракцию с температурой кипения от 39 *С до 40 *С.

8 Проведение испытания

8.1 Экстракция охратоксина А из пробы

В делительную воронку помещают пипеткой 5 см 3 пробы, добавляют 5 см 3 раствора хлористого натрия ло 7.2.3, приливают 5 см 3 смеси хлористого метилена и уксусной кислоты по 7.2.2 и встряхивают в течение 1 мин. После расслоения фаз нижний органический слой фильтруют через предварительно смоченный подкисленным хлористым метиленом фильтр ккрасная лента» в колбу для упаривания.

Примечание - При образовании стойкой эмульсии рекомендуется центрифугировать смесь в течение 2 мин при частоте вращения 5000 об/мин.

Повторяют экстракцию охратоксина А из верхнего слоя еще раз 5 см 3 смеси уксусной кислоты и хлористого метилена по 7.2.2. Полученный экстракт фильтруют в ту же колбу для упаривания.

Фильтр промывают подкисленным хлористым метиленом объемом от 5 до 10 см 3 . Экстракт упаривают до сухого остатка в вакууме, поместив колбу в водяную баню при температуре от 40 в С до 45 *С. Сухой остаток растворяют в 0.5 см* подвижной фазы, получая таким образом концентрат пробы.

Примечание -На стадии освоения метода, при смене партии экстрагента, а также при возникновении сомнений в достоверности получаемых результатов находят коэффициент прохождения охратоксина А в контрольной пробе в соответствии с приложением А и проверяют приемлемость полученного значения.

8.2 Проведение скрининга проб

Концентрат пробы вина, полученный по 8.1. выдерживают не менее 5 мин. и затем проводят его хроматографический анализ по 8.3.

При отсутствии на хроматограмме пика, идентифицируемого как пик охратоксина А. делают вывод об отсутствии охратоксина А в пробе на уровне нижней границы диапазона измерений (0.001 мг/дм 3) и пробу с добавкой охратоксина А не готовят.

Если на хроматограмме пробы обнаруживают пик. идентифицируемый программным обеспечением к хроматографу как пик охратоксина А (см. 8.3). то е анализируемую пробу вносят

добавку в виде раствора охратоксина А в подвижной фазе (см. 7.3.2). Рекомендуемый объем добавки раствора охратоксина A (V 4P . см 3) вычисляют по формуле

(6) где о - коэффициент, значение которого выбирают в диапазоне от 0.5 до 2.0:

С* - массовая концентрация охратоксина А в концентрате пробы (см.8.3). нг/см 3 ;

Ус- объем концентрата пробы, см 3 (0.5 см 3);

Сет - массовая концентрация охратоксина А в растворе, используемом для внесения добавки. нг/см 3 .

Объем вносимой добавки не должен превышать 5 % объема пробы (У пр. см 3). Если это требование не согласуется со значениями, рассчитанными по формуле (6). то для внесения добавки охратоксина А используют раствор с другим значением массовой концентрации.

Пробу с добавкой анализируют согласно 8.1.

8.3 Проведение хроматографических измерений

Регистрируют не менее двух хроматограмм концентрата испытуемой пробы (см. 8.1) и пробы с добавкой (см. 8.2), в тех же условиях, при которых была проведена градуировка хроматографа. Идентификацию охратоксина А проводят по совпадению времени удерживания охратоксина А в экстракте пробы с его временем удерживания, полученным при контроле стабильности градуировочной характеристики, установив ширину окна идентификации 5 %.

Пример хроматограммы приведен на рисунке Б.1 (приложение Б).

Примечание - При необходимости подтверждения правильности идентификации пика охратоксина А рекомендуется выполнить добавку раствора охратоксина А в подвижной фазе к концентрату пробы. О достоверности идентификации можно судить по увеличению высоты предполагаемого пика охратоксина А Количество добавляемого раствора охратоксина А определяют, исходя из того, что массовая концентрация охратоксина А в пробе должна увеличиться на (50 - 150) % по сравнению с исходным значением.

При наличии на хроматограмме концентрата пробы пика, идентифицированного как пик охратоксина А. вычисляют значение массовой концентрации охратоксина А в концентрате пробы для каждой зарегистрированной хроматограммы с использованием градуировочной характеристики, установленной по 7.5. и проверяют приемлемость полученных значений, используя условие (4). Если условие (4) выполняется, то в качестве результата измерений массовой концентрации охратоксина А в концентрате испытуемой пробы принимают среднеарифметическое значение полученных концентраций (Сх. нг/см 3). Если условие (4) не выполняется, то находят и устраняют причины нестабильности, после чего ввод концентрата пробы повторяют.

При анализе концентрата пробы с добавкой охратоксина А (см. 8.2) также регистрируют две хроматограммы, идентифицируют пик охратоксина А и рассчитывают значение массовой концентрации охратоксина в концентрате по каждой хроматограмме, проверяют приемлемость полученных значений и рассчитывают массовую концентрацию охратоксина А в концентрате пробы с добавкой (С Х 4 Д. нг/дм 3) как среднеарифметическое значение полученных значений.

Если массовая концентрация охратоксина А в концентрате пробы превышает 100 нг/см 3 , то пробу вина разбавляют водой по 6.11 и разбавленную пробу анализируют заново по 8.1. Коэффициент разбавления О вычисляют по формуле

где У р - объем разбавленной пробы, см 3 ;

У 4 - объем аликвоты испытуемой пробы, взятый для разбавления, см 3 .

9 Обработка результатов испытания

Массовую концентрацию охратоксина А в пробе вина (X. мг/дм) вычисляют по формуле

V---ц--:--о-ю ’

где С ст - массовая концентрация раствора охратоксина А. использованного в качестве добавки (см. 8.2). нг/см 3:

Объем добавки раствора охратоксина А к пробе (см. 8.2), см 3:

Урр - объем пробы, взятой для испытаний по 8.1. см 3 (5см 3);

С х - массовая концентрация охратоксина А в концентрате пробы (см. 8.3), нг/см 3:

С х. в ~ массовая концентрация охратоксина А в концентрате пробы с добавкой (см. 8.3). нг/см 3:

О - коэффициент разбавления пробы вина (см. 8.3). Если разбавление пробы не производили, то О г 1;

10" 3 - коэффициент согласования размерности единиц массы и объема.

10 Метрологические характеристики

Метод обеслечивает получение результатов измерений с метрологическими характеристиками, не превышающими значений, приведенных в таблице 2.

Таблица 2

Расхождение между двумя результатами измерений (Х| и Х 2 , мг/дм - *). полученными в одной лаборатории в условиях повторяемости, должно соответствовать условию

где X - среднее арифметическое X, и Х 2 . мг/дм:

Л>п. - предел повторяемости (таблица 2), %.

При выполнении условия (9) за результат измерений принимают среднеарифметическое полученных результатов измерений (X, и Х 2 . мг/дм 3).

Расхождение между двумя результатами измерений, полученными в двух лабораториях (Х 1гаС и Хане, мг/дм 3) на идентичных пробах, должно соответствовать условию

где Хпов - среднее арифметическое Х 1лв0 и Х^. мг/дм 3: СО 095 - критическая разность (таблица 2). %.

11 Контроль качества результатов измерений

Контроль показателей качества результатов измерений в лаборатории предусматривает проведение контроля стабильности результатов измерений с учетом требований ГОСТ ИСО 5725*6 (раздел 6).

12 Оформление результатов испытания

Результаты испытаний регистрируют в протоколе испытаний, который оформляют в соответствии с требованиями ГОСТ ИСО/МЭК 17025, при этом протокол испытаний должен содержать ссылку на настоящий стандарт.

Результаты измерений содержания охратоксина А (при подтвержденном в лаборатории соответствии аналитической процедуры требованиям настоящего стандарта) представляют в виде

Х±Л либо Х± U. (11)

где X -результат измерений, полученный в соответствии с разделом 10. мг/дм 3:

А - границы абсолютной погрешности измерений содержания охратоксина А {Р - 0,95), мг/дм 3 , которые вычисляют по формуле

А = 0.0!бГ: (12)

U - расширенная неопределенность при коэффициенте охвата к-2. мг/дм 3 , которую вычисляют по формуле 8

U = 0.CM (/ w х. {13)

Значения S (U„J приведены в таблице 2.

Числовые значения границ абсолютной погрешности (неопределенности) выражают числом, содержащим не более двух значащих цифр, при этом наименьший разряд числового значения окончательного результата измерений принимают таким же. как и наименьший разряд числового значения границ абсолютной погрешности (неопределенности).

Определение коэффициента прохождения охратоксина А

Для определения коэффициента прохождения охратоксина А используют контрольную пробу, для приготовления которой в делительную воронку помещают 5 см’ дистиллированной воды, добавляют 5 см’ раствора хлористого натрия по 7.2.3 и вносят 0.5 см* раствора охратоксина А массовой концентрации 50 нг/см’ в подвижной фазе (см. 7.3.2).

Проводят экстракцию охратоксина А по 6.1. приготавливают концентрат контрольной пробы по 8.2 и проводят его хроматографический анализ по 8.3 и. используя градуировочную характеристику по 7.5. выделяют массовую концентрацию охратоксина А в концентрате контрольной пробы.

Затем вычисляют коэффициент прохождения охратоксина А (п) по формуле

где V\ - объем концентрата контрольной пробы, см 9 (0.5 см*):

Сх - измеренное значение массовой концентрации охратоксина А в концентрате контрольной пробы, нг/см*:

С. - значение массовой концентрации охратоксина А в растворе по 7.3.2. нг/см*:

V. - объем раствора охратоксина А по 7.3.2. отобранный для приготовления контрольной пробы, см* (0.5

Коэффициент прохождения охратоксина А определяют не менее трех раз в условиях повторяемости. Полученные значения должны соответствовать следующим требованиям:

Каждое из полученных значений не менее 0,8:

Относительное значение размаха полученных значений соответствует условию

I П||Ж Пчии I

где iv«t и tv». - наибольшее и наименьшее из полученных значений коэффициента прохождения охратоксина А: ц - среднеарифметическое полученных значений коэффициента прохождения охратоксина А.

Если оба этих условия выполняются, то проведение операций по 8.1 считают удовлетворительным. В противном случае находят причины потерь охратоксина А и повторяют определение коэффициента прохождения.

Приложение Б (справочное)

Пример хроматограммы

полусладкого

На рисунке Б.1 приведен пример хроматограммы концентрата пробы вина красного (массовая концентрация охратоксина А в пробе 0,0010 мг/дм 1).

концентрации

Рисунок Б.1 - Пример хроматограммы

Пик охратоксина А (на рисунке обозначен как ОТА) соответствует значению массовой охратоксина А в концентрате 7.7 нг/см*.

УДК 543.544.5.068.7:663.2:006.354 МКС 67.160.10

Ключевые слова: вино, виноматериалы. методы испытаний, высокоэффективная жидкостная хроматография, охратоксин А. экстракция охратоксина А. определение массовой концентрации охратоксина А. концентрирование экстракта, скрининг проб, флуориметричесхое детектирование

Редактор К.В. Дудко Корректор П.М. Смирнов Компьютерная еерстка Е.К. Кузиной

Подписано в печать 08.02.2016. Формат 60x84V*.

Уел. печ. л. 1,86. Тираж 45 экз. За*. 3872.

Подготовлено на основе электронной версии, предоставленной разработчиком стандарта